За последние несколько десятилетий проблема бесплодия для супружеских пар стала гораздо актуальнее, чем раньше. Своевременное обращение за помощью к специалистам и современные методы обследования, как правило, позволяют быстро найти причину долгого отсутствия беременности, устранить ее или выбрать подходящий метод ВРТ. Частота обнаружения мужского фактора бесплодия практически равна частоте диагностики женского бесплодия. Действительно, существует огромное количество факторов, способных негативно влиять на мужскую фертильность. И иногда после обследований и анализов мужчины слышат диагноз «делеция AZF».

Анализ на делецию AZF

Несмотря на малораспространенное название, анализ на AZF является одним из самых информативных обследований, по результатам которого можно говорить о возможных проблемах в сперматогенезе мужчины.

Его суть заключается в проверке работоспособности Y-хромосомы как в целом, так и конкретных ее отделов. AZF – это фактор азооспермии. В его составе три региона, отвечающие за возникновение, развитие и выпуск сперматозоидов. Для удобства их обозначают буквами A, B, C. В ходе исследования может быть обнаружено отсутствие одного из отделов.

Материалом исследования является слюна мужчины, которая собирается специальной ватной палочкой с внутренней стороны щеки.

При обследовании полученного биологического материала специалист проверяет не только AZF делецию, но и другие важные показатели, которые могут указать на причину мужского бесплодия. Среди них:

• проверка на предмет наличия наследственных патологий;
• определение количества здоровых сперматозоидов, достаточного для проведения ЭКО и ИКСИ;
• составление прогноза вероятности наследования будущим потомством отцовских репродуктивных проблем;
• разностороннее изучение возможных причин снижения фертильности мужчины;
• поиск вариантов коррекции назначенного лечения в целях увеличения его эффективности.

Результаты анализа на делецию AZF

В ходе исследования фактора азоспермии проверяется как наличие всех трех областей (A, B и С), так и, в случае отсутствия какой-либо из них, определяется название ненайденной. Результат анализа фиксируется в специально форме, где напротив каждого из отделов ставится + или -, указывающие на наличие или отсутствие делеции соответственно.

Согласно установленной системе обозначений, полное отсутствие делеций в исследуемом образце будет выглядеть как:

Когда делеция AZF имеет место, то кроме плюса в полученном результате анализа пациент может увидеть знак del.

В заключение лаборанта будет значиться одно из двух:

1. Наиболее частые делеции не обнаружены.

2. Делеции обнаружены в N-ном отделе (где N-название конкретного отдела Y-хромосомы).

Также специалист подготовит общее заключение по проведенному исследованию, в котором укажет на состояние сперматогенеза в Y-хромосоме. Если клиническая картина положительная, то мужчине необходимо сдать дополнительные анализы.

Описание

Метод определения ПЦР в режиме реального времени (Real-Time PCR).

Исследуемый материал Цельная кровь (с ЭДТА)

Доступен выезд на дом

Исследование применяют для выявления 6 микроделеций AZF-региона Y-хромосомы- маркёра генетически обусловленного бесплодия у мужчин.

Мужское бесплодие - нарушение функции мужской репродуктивной системы. Наиболее распространенным и эффективным методом оценки мужской фертильности в настоящее время признана спермограмма. Однако этот метод не позволяет выявить причину нарушений. 30–50% случаев серьезных изменений показателей спермограммы обусловлены генетически.

Наиболее часто встречающиеся генетические факторы, которые могут приводить к мужскому бесплодию - это делеции Y-хромосомы в регионе, названном «фактор азооспермии» (AZF).

Локус AZF находится в эухроматиновой области длинного плеча Y-хромосомы, картирован в сегменте Yq11.22-23 и содержит большое количество генов, ответственных за формирование и развитие сперматозоидов. В этом регионе были обнаружены как крупные делеции, выявляемые с помощью цитогенетических методов, так и большое количество микроделеций.

Следует учитывать, что микроделеции – это делеции, не выявляемые с помощью цитогенетического анализа, но они могут приводить к широкому спектру нарушений фертильности у мужчин: от незначительного снижения количества сперматозоидов до полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах. Делеции AZF-локуса стоят на втором месте по частоте встречаемости среди всех генетических причин мужского бесплодия (после нарушений кариотипа). Микроделеции локуса Y-хромосомы обнаруживаются в среднем в 10-15 % случаев азооспермии и в 5–10 % случаев олигозооспермии тяжелой степени.

Локус AZF условно разделен на три субрегиона: AZFa, AZFb и AZFс. В каждом субрегионе локализованы гены, вовлеченные в контроль сперматогенеза. Делеции, имеющие клинические проявления в виде тяжелой олигозооспермии и азооспермии, могут затрагивать один локус AZF или более.

Для проведения данного вида исследований рекомендуется использовать определенные STS-маркеры (sequence-tagged sites – высококонсервативные уникальные последовательности ДНК), локализованные на длинном плече Y-хромосомы в различных областях AZF-локуса. Отсутствие у пациента какого-либо маркера или группы маркеров свидетельствует о делеции соответствующей области AZF-локуса

Субрегион AZFa содержит гены – USP9Y (DFFRY) и DDX3Y (DBY). Маркеры, позволяющие выявлять делеции этого субрегиона, имеют обозначения sY84, sY86 и sY615. Считается, что даже одного неполиморфного STS-маркера достаточно для идентификации делеции в субрегионе AZFa, но увеличение количества маркеров повышает точность диагностики и поэтому рекомендуется использование хотя бы двух маркеров – sY84 и sY86. Делеции этого субрегиона встречаются с низкой частотой – примерно 5% от всех микроделеций Y-хромосомы.

В субрегионе AZFb картирован ген RBMY, который является высококопийным геном (от 30 до 40 копий). Делеции локуса AZFb встречаются примерно в 16% среди всех микроделеций Y-хромосомы.

Делеции субрегиона AZFc встречаются чаще всего – до 60% всех микроделеций Y-хромосомы. В этом участке находится семейство генов DAZ (Deleted in Azoospermia – гены, делетированные при азооспермии). Для делеции b2/b4 субрегиона AZFc высокоспецифичны два маркера: sY254 и sY255, в случае этой делеции теряются все копии гена DAZ.

Среди микроделеций Y-хромосомы в 15% случаев встречаются микроделеции сразу нескольких субрегионов.

По литературным данным большинство микроделеций AZF-локуса представляют собой мутации de novo. Это может быть связано с индивидуальной склонностью к возникновению Y-микроделеций вследствие особенностей структуры Y-хромосомы, носительством каких-либо полиморфизмов, предрасполагающих к таким потерям.

Однако, при одних и тех же типах делеций Y-хромосомы и даже идентичных микроделециях может наблюдаться вариабельность фенотипического проявления, что обусловлено влиянием большого числа генетических (хромосомные, геномные, эпигенетические изменения), а также негенетических факторов (инфекции, гипогонадизм, варикоцеле и т.п.), оказывающих влияние на сперматогенез. Кроме того, у пациентов с микроделециями AZF-локуса, имеется вероятность ухудшения состояния сперматогенеза с возрастом, в связи с чем, раннее выявление наличия генетических изменений в структуре генов этого региона Y-хромосомы, позволяет своевременно провести криоконсервацию сперматозоидов в молодом возрасте для их дальнейшего использования в циклах ВРТ.

Литература

1. Материалы фирмы-производителя тест-системы.
2. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Ширшова Л.С., Чухрова А.Л., Ковалевская Т.С., Поляков А.В., Гоголевский П.А., Калугина А.С., Морина Г.В., Тогобецкий А.С., Здановский В.М., Гоголевская И.К., Крамеров Д.Н. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований. Медицинская генетика. - М. 2003; Т.2, №8: 367-378..
3. C. Krausz, L. Hoefsloot, M. Simoni and F. Tüttelmann EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: state-of-the-art 2013. Andrology, 2014, 2, 5-19.
4. Беляева Н.А., Глинкина Ж.И., Калинина Е.А. Современные аспекты проблемы мужского беспложия, ассоциированного с мутацией AZF локуса хромосомы Y. Акушерство и Гинекология. – М. 2012; №8-2. Электронная версия статьи.

Подготовка

Специальной подготовки к исследованию не требуется.

Показания к назначению

• при тяжелых формах гипосперматогенеза неясной этиологии (олигозооспермия <5 млн сперматозоидов/мл эякулята; азооспермия)
• в комплексе диагностических методов при обследовании бесплодной пары;
• для решения вопроса о выборе адекватных способов преодоления бесплодия;
• для оценки риска нарушений фертильности у сыновей мужчин с выявленными делециями AZF.

Мужчина-партнер может быть проверен на бесплодие или субфертильность (пониженную плодовитость) с помощью целого ряда клинических методов, а также с использованием лабораторного исследования спермы ("Руководство ВОЗ для лабораторного исследования и обработки человеческой спермы", 2010 г.).

AZF - фактор азооспермии

Микроделеции локуса AZF Y хромосомы (Azoospermia Factor, фактор азооспермии)

Специалисты нашего Центра первыми в Беларуси использовали определение данного вида мутации для диагностики причин мужского бесплодия.

Микроделеция Y хромосомы - это выпадение определенных участков Y хромосомы - AZF локуса (фактора азооспермии). AZF локус находится в длинном плече Y-хромосомы (Yq11). Гены, расположенные в этом локусе, играют важную роль в процессе сперматогенеза.

Исследование микроделеции локуса AZF Y хромосомы в ряде случаев позволяет:

1. установить генетическую причину нарушений сперматогенеза;
2. проводить дифференциальную диагностику бесплодия у мужчин;
3. корректировать терапевтические подходы, избегая «лишнего» лечения, а также;
4. прогнозировать возможность получения сперматозоидов для ИКСИ или ЭКО;
5. прогнозировать возможность получения сперматозоидов при тестикулярной биопсии;
6. прогнозировать для потомства мужского пола возможность наследования репродуктивных проблем отца;
7. рекомендовать использование предимплантационной диагностики для исключения наследования репродуктивных проблем отца.

Бесплодием страдают около 25% супружеских пар, при этом примерно в 60% случаев оно обусловлено нарушением репродуктивной функции со стороны мужчин. Бесплодие у мужчин в 40-50% случаев может быть связано с нарушениями количественных и/или качественных показателей эякулята. Примерно у 31,7% мужчин причину бесплодия установить не удается (идиопатическое бесплодие). Предполагается, что оно обусловлено генетическими или иммунологическими факторами.

Сперматогенез представляет собой сложный многоэтапный процесс, завершающийся образованием зрелых мужских половых клеток - сперматозоидов. Данный процесс контролируется большим количеством генов, расположенных как на аутосомах, так и на гоносомах (половых хромосомах), в особенности на Y-хромосоме. Мутации генов, контролирующих этапы сперматогенеза, могут приводить к нарушению подвижности, морфологических и фертильных свойств сперматозоидов, блоку сперматогенеза, проявляясь в диапазоне от легкого снижения сперматогенной активности до полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах (синдром «только клетки Сертоли»).

Механизм возникновения Y-микроделеций еще не совсем понятен. Однако ясно, что основной причиной высокой частоты микроделеций Y-хромосомы является ее нестабильность и склонность к потере генетического материала. Это может быть обусловлено наличием большого числа различных повторов (Alu-повторов и др.), действием мобильных генетических элементов (эндогенных вирусов и др.), а также потерей генетического материала в случаях аберрантной рекомбинации между гомологичными областями X- и Y-хромосом или несбалансированными обменами между сестринскими хроматидами Y-хромосомы. Исследования ДНК Y-хромосомы показали ее высокую полиморфность. Вероятно, некоторые субъекты в большей мере, чем другие, склонны к возникновению Y-микроделеций вследствие особенностей структуры Y-хромосомы у них, носительством полиморфизмов ДНК, предрасполагающих к таким потерям.

Так, микроделеции локуса AZF (Azoospermia Factor, фактор азооспермии) хромосомы Y обнаруживаются в среднем в 10-15% случаев азооспермии и в 5-10% случаев олигозооспермии тяжелой степени и обусловливают нарушения сперматогенеза и бесплодие у мужчин. AZF-локус содержит три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc . Каждый из них содержит ряд генов, мутации которых приводят к азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени.

Делеции AZFa- и AZFb-субрегионов ассоциированы с невозможностью получения зрелых половых клеток, а у пациентов с AZFс-делециями примерно в 71% случаев удается получить зрелые сперматозоиды. Так как, у пациентов с AZF-микроделециями часто отмечается прогрессирование нарушений сперматогенеза от олигозооспермии до азооспермии, таким пациентам необходима криоконсервация полученных сперматозоидов.

Обобщение многочисленных данных показывает, что AZF-микроделеции обнаруживаются у 7,3% мужчин с бесплодием. Большая часть (66%) микроделеций найдена у пациентов с азооспермией, в 28% случаев - у пациентов с олигозооспермией тяжелой степени.

Выбор пациентов для проведения микроделеционного анализа

1. Так как, чаще всего, микроделеции обнаруживаются у мужчин с идиопатическим бесплодием (бесплодием неясного генеза), то им в первую очередь показано обследование AZF-локуса на наличие микроделеций.
2. Данное исследование необходимо проводить всем мужчинам перед планируемым ИКСИ из-за высокого риска передачи Y-микроделеций сыновьям.
3. Кроме того, исследование AZF-локуса на наличие микроделеций должно выполняться у мужчин с показателем количества сперматозоидов менее 5 млн/мл, т.е. с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени.

Репродуктивные технологии и AZF-микроделеции

1. Применение репродуктивных технологий (ВРТ), и, в частности, такого метода, как ИКСИ, позволяет части пациентов с микроделециями AZF-локуса иметь потомство, однако плоды мужского пола имеют высокий риск наследования Y-микроделеций, соответственно, репродуктивных проблем отца.
2. Пациентам с AZF- микроделецией Y хромосомы возможно рекомендовать использование предимплантационной диагностики пола эмбриона при применении ЭКО с целью переноса эмбрионов женского пола, которым невозможна передача наследования данного вида бесплодия.
3. Пациенты должны быть информированы для принятия решения о применении ВРТ.
4. Поэтому перед планируемым ЭКО в рамках обследования супружеской пары мужчинам с количеством сперматозоидов в эякуляте менее 5 млн/мл необходимо провести микроделеционный анализ Y-хромосомы (при азооспермии и олигозооспермии тяжелой степени).
5. Делеции AZFa- и AZFb-субрегионов ассоциированы с невозможностью получения зрелых половых клеток, таким образом, при проведении диагностической биопсии у данных пациентов получить сперматозоиды невозможно. Следовательно, данным пациентам необходимо рекомендовать иные пути решения репродуктивных проблем: донорские программы или усыновление.
6. У пациентов с AZF с-делециями примерно в 71% случаев удается получить зрелые сперматозоиды.
7. Наличие AZF- микроделеций обусловливает неэффективность консервативного лечения, направленного на повышение сперматогенеза (увеличение количества сперматозоидов), однако при AZF с - делеции при подготовке к ВРТ необходима терапия, направленная на коррекцию гормонального и метаболического статуса мужчины для получения морфологически качественных сперматозоидов.
8. Так как, у пациентов с AZF-микроделециями часто отмечается прогрессирование нарушений сперматогенеза от олигозооспермии до азооспермии, таким пациентам необходима криоконсервация полученных единичных сперматозоидов.

Комплексное исследование, которое позволяет определить ведущие генетические причины мужского бесплодия и выбрать соответствующую тактику лечения пациента.

В исследование включено выявление делеций в области локуса AZF, влияющих на сперматогенез, и определение количества CAG-повторов в гене AR, связанных с изменением чувствительности к андрогенам.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Буккальный (щечный) эпителий, венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Подготовки не требуется.

Подробнее об исследовании

Бесплодием страдает 15-20 % пар репродуктивного возраста. В половине случаев оно связано с «мужским фактором», проявляющимся отклонениями в параметрах эякулята. Частыми причинами мужского бесплодия являются нарушения структуры и количества сперматозоидов, влияющие на их подвижность и способность к оплодотворению. Важную роль в развитии таких патологий, как олигозооспермия и азооспермия, играют отклонения в специфическом участке Y-хромосомы – AZF-локусе. Входящие в AZF-локус гены определяют нормальное протекание сперматогенеза, и при нарушении генетической структуры AZF-локуса образование мужских половых клеток может серьезно нарушиться.

Локус AZF, получивший название «фактора азооспермии», разделен на 3 участка: AZFa, AZFb и AZFc. В каждом из них идентифицированы гены, участвующие в контроле сперматогенеза. Делеции в локусе AZF могут быть полными, т.е. целиком удаляющими один из AZF-регионов или более, и частичными, когда они не полностью захватывают какой-либо из трех его регионов.

При полных AZF-делециях прослеживается довольно четкая зависимость степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации делеций, что может иметь прогностическое значение в получении сперматозоидов, пригодных для программ экстракорпорального оплодотворения.

• Отсутствие всего локуса AZF, а также делеции, целиком захватывающие регионы AZFa и/или AZFb, указывают на невозможность получения сперматозоидов.
• Практически у всех пациентов с делециями AZFb или AZFb+c отмечают азооспермию вследствие тяжелых нарушений сперматогенеза (синдрома «только клетки Сертоли»).
• При полных делециях региона AZFc проявления варьируются от азооспермии до олигозооспермии. В среднем у 50-70 % пациентов с делецией, целиком захватывающей AZFс-регион, удается получить сперматозоиды, пригодные для искусственного оплодотворения.
• При частичных AZFс-делециях проявления варьируются от азооспермии до нормозооспермии.

В генетическом контроле развития по мужскому типу особо важен ген SRY (Sex-determining Region Y). Именно в нем обнаружено наибольшее количество мутаций, связанных с дисгенезией гонад и/или инверсией пола. При отсутствии участка хромосомы, содержащего ген SRY, фенотип будет женский при мужском кариотипе 46ХУ.

В данное генетическое исследование входит анализ структуры AZF-локуса Y-хромосомы, а также определение делеции гена SRY.

Другим определяющим фактором мужского бесплодия является нарушение гормональной регуляции сперматогенеза, ключевую роль в котором играют мужские половые гормоны андрогены.

Когда назначается исследование?

• При нарушении сперматогенеза неясной этиологии.
• При нарушении сперматогенеза при сохраненной эндокринной функции яичек.
• При диагностике причин бесплодия у мужчин.
• При определении терапевтического подхода к получению сперматозоидов для ЭКО (и прогнозировании его возможности).
• При раке предстательной железы в семейном анамнезе.
• В случаях нарушения репродуктивной функции по мужской линии в семейном анамнезе.

Что означают результаты?

• Делеция AZFa: sY84, sY86 – негативный прогноз в отношении получения сперматозоидов с помощью биопсии яичка.
• Делеция AZFb: sY127, sY134 – негативный прогноз в отношении получения сперматозоидов с помощью биопсии яичка.
• Делеция AZFc: sY254, sY255 – высокая вероятность получения сперматозоидов, пригодных для искусственного оплодотворения.
• Делеция SRY – нарушение дифференцировки гонад по мужскому типу, женский фенотип.

Количество повторов гена AR. Верхней границей нормы для определения риска генетической предрасположенности к гормонозависимому нарушению сперматогенеза является 23 CAG-повтора. По некоторым источникам, диапазон 20-26 повторов считается относительной нормой.

Важные замечания

• Если обнаружены микроделеции AZFa или AZFb Y-хромосомы, не рекомендуется выполнение процедуры по выделению сперматозоидов, так как шанс их обнаружения чрезвычайно низок.
• Cледует помнить, что выявленные нарушения не будут передаваться по женской линии и в случае успешного использования вспомогательных репродуктивных технологий все дети мужского пола унаследуют от отца изменения в Y-хромосоме.
• Мальчики, рожденные после применения ИКСИ у отцов с микроделециями в Y-хромосоме, подлежат диспансерному наблюдению для оценки их фертильного статуса.

Интерпретация результатов

Результаты исследования должны интерпретироваться врачом в комплексе с другими генетическими, анамнестическими, клиническими и лабораторными данными.